在食品、醫藥、可降解塑料等行業，L-乳酸扮演著關鍵角色。但傳統工藝需加入大量中和劑，不僅成本高，還帶來廢渣污染。乳酸作為一種關鍵的生物基化學原料，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品及可降解塑料（如聚乳酸PLA）等多個領域。然而，傳統微生物發酵在生產L-乳酸過程中，由于微生物對酸性環境耐受性差，乳酸積累會迅速導致pH下降，嚴重抑制微生物生長，影響發酵效率。為維持發酵平衡，通常需要大量添加中和劑如碳酸鈣，不僅提高生產成本，還伴隨副產物如硫酸鈣的生成，帶來環境與資源負擔。
近日，江南大學呂雪琴教授團隊在《J. Agric. Food Chem.》發表研究成果，成功打造出全球首例在pH 2.6無中和劑條件下高效生產乳酸的釀酒酵母菌株，產量高達76.2 g/L，生產效率刷新紀錄！
圖1 文獻基本信息
圖2 圖形摘要
在本研究中，為實現基因定點敲除與重組菌株構建，作者首先利用攜帶Cas9表達框和sgRNA表達盒的PML104質粒構建了釀酒酵母的CRISPR-Cas9系統，同時質粒還包含用于篩選的尿嘧啶選擇標記。在該系統中，sgRNA可指導Cas9蛋白在目標DNA上產生雙鏈斷裂，隨后借助上下游長度為1000 bp的同源臂介導的同源重組機制完成靶基因的敲除或整合。三段所需的DNA片段均通過PCR擴增獲得，并在設計時保留有50 bp的重疊序列，以促進DNA片段的重組拼接。線性片段和質粒以2∶1的比例共轉化入感受態釀酒酵母細胞，以構建重組菌株。
為了提高酵母菌株對酸性環境的適應能力，作者進一步實施了適應性實驗室進化實驗。在該過程中，以L-乳酸為選擇壓力，通過逐步調控酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培養基的pH值，實現對酵母菌株的選擇進化。此外，為實現外源基因的高效表達，作者對目標基因進行了密碼子優化。
圖3 篩選耐L-乳酸的釀酒酵母底盤菌株
圖4 乳酸脫氫酶的篩選
為評估重組釀酒酵母在不同發酵條件下生產 L-乳酸的能力，作者首先在實驗室規模下進行了搖瓶發酵實驗。具體而言，預培養的酵母種子液在含 3 mL YPD培養基中培養約 20 小時后，接種至 250 mL 厭氧搖瓶中，每瓶含 40 mL YPD培養基，發酵過程在 30℃、220 rpm 條件下進行 48 小時，并采用間歇葡萄糖補料以維持碳源供給。每個菌株均設置三個平行重復，以確保數據的可重復性與統計學穩健性。進一步地，為考察其在放大培養條件下的代謝性能，作者在 5 L 生物反應器中進行了規模化發酵。使用的發酵培養基中包含了大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、KH?PO?、MgSO?、檸檬酸及微量金屬元素和維生素，以支持酵母細胞的生長和產酸能力。發酵過程在 30℃、200 rpm、厭氧環境下持續約 36 小時，并通過連續補料的方式將葡萄糖濃度維持在 5 g/L 左右，整個過程中未添加中和劑。
圖5 通過“推-拉-抑制”策略提高L-乳酸產量
圖6 轉運蛋白和輔因子工程進一步提高L-乳酸滴度
為定量分析目的基因的表達水平，研究團隊利用熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）技術對關鍵轉錄本進行了檢測。總RNA提取采用市售RNA提取試劑盒完成，經RT-PCR合成的cDNA用作熒光定量分析模板。qPCR反應體系體積為 20 μL，使用 SYBR Premix Ex Taq 試劑，內參基因為釀酒酵母 18S rDNA，實時熒光檢測則在 Roche LightCycler 480 II 系統上進行。發酵產物中 L-乳酸的濃度通過高效液相色譜（HPLC）進行檢測。
本研究圍繞L-乳酸的綠色生物制造，構建并優化了多種工程化釀酒酵母菌株，實現了在無中和劑條件下的高效發酵生產。通過適應性實驗室進化，作者成功獲得了能夠耐受pH 2.60的工程菌株TMG2，為后續代謝通路的精準重構奠定了穩定的底盤基礎。在此基礎上，研究團隊篩選出高活性的乳酸脫氫酶LLDH，并進一步引入“推—拉—抑制”代謝策略，實現了L-乳酸合成路徑的系統優化，其中TMG16菌株的終產物滴度達到了46.8 g/L。
本研究的亮點在于整合長期適應性進化與多層次代謝工程手段，不僅顯著提高了菌株對強酸環境的適應能力，也在無中和劑條件下大幅提升了L-乳酸的產量和生產效率，為綠色、可持續的生物制造提供了有效策略。該體系的建立對于減少傳統中和劑使用、降低生產成本和減緩環境負擔具有重要現實意義。
參考文獻：Baoyuan Guo, Wenwen Yu, Xianhao Xu, et al. Adaptively Evolved and Multiplexed Engineered Saccharomyces cerevisiae for Neutralizer-Free Production of L?Lactic Acid. ACS.jafc.4c12575.DOI:10.1021/acs.jafc.4c12575
來源：微生物安全與健康網，作者~趙瑾。
